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衛生情報(畜産技術ひょうご81号 発行:2006年3月20日)
題名 兵庫県内バルク乳の乳房炎起因菌保菌状況と細菌学的特性
筆者 姫路家畜保健衛生所
病性鑑定課 技術吏員 清水 優花
目 的
   乳房炎による酪農家のは、体細胞数増加によるペナルティーの付加、乳房炎牛の淘汰だけでなく、潜在性乳房炎による泌乳量の減少及び乳質の低下等が挙げられる。特に黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus :以下SAという)による乳房炎は難治性で、伝染性が強く農家の経済的損失は大きく問題となっている。しかし、これまで県内酪農家の乳房炎起因菌による汚染状況を調べた報告はなく、現状が把握できていない。今回 KITACO タンデムバー FORZA(MF10) 《キタコ 652-1813900》、月別にみて体細胞数が高い6月のバルク乳を用いて 【USA在庫あり】 ジョーカーマシン JOKER MACHINE シフトハンドル ポラリス RZR 1000 XP ミル シルバー 0618-0024 JP店、伝染性乳房炎起因菌であるSA、無乳性レンサ球菌(Streptococcus agalactiae)、環境性乳房炎起因菌である腸内細菌群による汚染状況を調べた。さらに分離されたSAについては遺伝子型別、表現型別によるタイプ分けを行い、その細菌学的特性や地域による特徴、まん延している農家におけるSAの動態を調査した。
1.材料と方法
調査1 : 県内酪農家バルク乳の乳房炎起因菌分離状況
 平成17年6月に生乳検査所で採取したバルク乳678検体を用いた。バルク乳を5%緬羊血液加寒天培地、DHL寒天培地にそれぞれ塗抹し、37℃18時間培養した。SAの同定は一次鑑別(グラム染色、カタラーゼ反応)、同定キット グロンドマン 国産シートカバー W650(99年 EJ650A1/C1) カーボンブラック(シルバーライン)/赤パイピング(張替)[GH5557KC1654P40]、PCR法により行った。同様に無乳性レンサ球菌も、一次鑑別を行い、キットでB群レンサ球菌に分類されたものを無乳性レンサ球菌と同定した。腸内細菌群はDHL寒天培地に生えた赤色コロニーを釣菌し、一次鑑別、オキシダーゼテストにより同定した。
調査2 : バルク乳から分離されたSAの細菌学的特性
 調査1で同定したSA(バルク乳156検体由来、1バルク乳あたり最大3株分離)346株について以下の型別を実施した。
遺伝子型別方法
・パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)による遺伝子解析
 PFGEは勝田変法により行った。制限酵素はSmaⅠを用いた。系統樹解析はBio-Rad社のfinger printing plusを用いた。
表現型別方法
・コアグラーゼ型別
 コアグラーゼ型別には、ブドウ球菌コアグラーゼ型別用免疫血清(デンカ生研)を使用した。
・エンテロトキシン保有の有無
 エンテロトキシン型別は、PCR法と逆受身ラテックス凝集反応(RPLA法)で行った。PCR法はTaKaRaのPrimers Set(A~E)を用いた。RPLA法はPCRで陽性となったSAについてSET-RPLA「デンカ生研」を用いて行った。
・毒素性ショック症候群毒素(tsst)の有無
 tsstの検出はPCR法とRPLA法で行った。PCR法は、TaKaRaのPrimers Setを使用した。RPLA法はPCR法で陽性となったSAについてTST-RPLA「生研」を用いて行った。
・薬剤感受性試験
 薬剤感受性試験はアンピシリン(ABPC)、セファゾリン(CEZ)、カナマイシン(KM)、エリスロマイシン(EM)、オキシテトラサイクリン(OTC)、シプロフロキサシン(CPFX)の6薬剤について1濃度ディスク法を行い、メーカーが示すカテゴリー(感受性、中間、耐性)に分類した。
調査3 : 汚染農家におけるSAの動態
 対尻式で搾乳牛49頭繋ぎ飼育している中規模農家で調査した。初妊牛または経産牛を導入し、自家育成は行っていない。全頭検査で約半数の乳汁からSAが分離された。乳汁から分離されたSA19検体についてPFGEを行った。
2.結 果
調査1
 バルク乳678検体中156検体(23.0%)よりSA、11検体(1.6%)より無乳性レンサ球菌、96検体(14.2%)より腸内細菌が分離された(図1)。
 またSAと無乳性レンサ球菌の両方が分離されたバルク乳は2検体、SAと腸内細菌の両方分離されたのは17検体、3種類すべてが分離されたのは1検体のみであった。
 飼養規模による起因菌陽性率の違いは 、SAでは20頭以下の小規模または81頭以上の大規模酪農家が10.3~17.6%と比較的低かったが、21~80頭の中規模の酪農家で27~30%と高かった(図2)。無乳性レンサ球菌、腸内細菌はそれぞれ2%、15%前後で飼養規模による差はみられなかった。
調査2
 検査した346株のうち同一バルク乳から異なるPFGEパターンを示した株が見られたのは2検体のみであった。
 PFGEパターンを解析したところ16種類(a~j型)に分類された(図3)。158株中109株(69.0%)がh2型であった。系統樹解析により遺伝的に近縁と思われるc1~c6型とh1、h2型の2系列が見られた。
 コアグラーゼ型は約80%がⅥ型でⅦ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴの順に多く見られた(図4)。エンテロトキシンA~E、tsst遺伝子保有状況は、保有しないSAが82.3%で、保有するSAの中ではエンテロトキシンCとtsstを同時に保有するものが最も多かった。RPLA法では2検体を除きすべてPCR法の結果と同一のエンテロトキシンが検出された。また人に食中毒を起こすコアグラーゼⅣまたはⅦ型で、エンテロトキシンAを保有するSAは1バルク乳のみから分離された。
 薬剤耐性率は6薬剤のうちABPCが最も高く(11.4%)、

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、その他の薬剤については3.2%以下であった(CEZ 0.6%、KM 3.2%、EM 2.5%、OTC 2.5%、CPFX 0.6%)(表2)。2種類以上の薬剤に耐性を示したSAは5検体(3.2%)であった。
調査3 
 PFGEを行った19検体中18検体が同一パターンであった。
3 考察
調査1
 SA感染は排菌量が乳量や泌乳ステージによって変動する。無乳性レンサ球菌の感染では1頭あたりの排菌量が多い。そのため、SA保有農家の実態は今回のバルク乳検査結果よりも高いものと推察している。また、バルク乳体細胞数が低い農家のバルク乳からもSAは分離されている。このことから [Dotty] ダティ ラグジュアスポルト FNクラス シートカバー クラウンロイヤル GRS180 / GRS181 / GRS182 / GRS183 H19/07~H20/02 5人乗 [3.0(2.5)ロイヤルサルーンプレミアムエディション 他] ※北海道は送料2160円(税込) 沖縄・離島は送料2916円(税込)、臨床症状や体細胞数の増加を示さない場合、農家がSA感染を気付かず、他の牛へ伝播させいている危険性もある。腸内細菌は乳汁由来菌だけでなく、搾乳中または搾乳器具の汚染も考慮する必要がある。
調査2
 PFGE、コアグラーゼ血清型、エンテロトキシンの有無による型別を行ったところ、SAは28種類のタイプに分類できた。その中で、2検体以上みられたのは11種類のタイプであった(表1)。全国の牛乳汁由来SAのタイプ分けを行った秦らの報告によると、全国的に広く分離されるSAはタイプ7または8(Type A)であり、北海道の乳汁の40%以上から分離されたSAと同じものはタイプ3から6(Type B)であったと報告している。本県の調査では61.4%がType Aで、10.8%がType Bであった。
 本県で多かったType A、北海道で多くみられるType Bとそれ以外の3種類に分けて県内の分布状況を図示した(図5)。Type AはSAが分離できたほとんどの地域で見られ、Type BはType Aほど全県的に浸潤していない。また、Type Bは県外導入牛や預託を行っている農家でみられるものの、県外導入を行っていない農家でもみられることから、現在では導入の有無に関係なく広がっている。Type A、B以外のSAが分離された農家は比較的飼養頭数が少なく、県外導入も行っていない農家であった。
 人に食中毒を起こすと報告されているSA(コアグラーゼⅣ型、エンテロトキシンA型)が分離された農家で、全頭の乳汁細菌検査を行ったが、SAは分離されず、搾乳器具の汚染が考えられた。現在、搾乳器具の清掃を行うなど指導を継続している。
 薬剤に対する耐性パターンの結果は検体数に差があるものの大きな差はなかった(表2)。
調査3
 SA汚染農場において分離されたSAのPFGEパターンは18検体がh2型で、1検体がc5型であった。自家育成を行わず導入牛の多い農家であったことから、多くのPFGEパターンを予測していたが、ほぼ同一のPFGEパターンをもつSAがまん延していたことから ディクセル PD1510943RL 純正補修向けブレーキローター(ブレーキディスク) フロント用 防錆コーティングを施し純正+αの性能を実現!、特定のSAが搾乳器具や人を介し伝播したものと推察している。
4.まとめ
 生乳検査所で採取した県内のバルク乳を用い乳房炎起因菌汚染状況調査として、SA、無乳性レンサ球菌、腸内細菌群の浸潤状況を調べた。SAの細菌学的特性を調査したところ、6割は全国的にみられるタイプであり、県内の広い地域でみられた。また、一農家で分離されたSAはほとんどが同タイプであったことから、搾乳器具を介した伝播が疑われ、搾乳衛生の徹底が農家内SAのまん延防止に重要である。今後、各タイプによる臨床症状の違い、治療・対策方法などについても検討していきたい。最後にバルク乳採材にご協力いただきました兵庫県酪農農業協同組合連合会生乳検査所、並びに系統樹解析にご協力いただきました動物衛生研究所臨床疫学研究室の諸先生方に深謝します。
表1 PFGE、コアグラーゼ血清型、エンテロトキシンによる分類
表2 バルク乳由来SAタイプごとの耐性数
図1 県内バルク乳から分離された菌の割合
図2 飼養頭数と各細菌の陽性率
図3 PFGEパターンと系統樹解析
図4 コアグラーゼ血清型、

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、毒素遺伝子保有状況
図5 兵庫県内での分布
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